Mikä on peptidisynteesi

 

Peptidisynteesi on proteiini- ja peptidikemian aktiivinen ala, johon tyypillisesti liittyy aminohappojen peräkkäinen lisääminen määrätyssä järjestyksessä peptidiketjun muodostamiseksi kemiallisin menetelmin. Tärkeimmät synteesimenetelmät ovat nestefaasi- ja kiinteäfaasisynteesi. LPPS:ään verrattuna SPPS:n etuna on se, että se on nopeampi, yksinkertaisempi, sillä on vähemmän sivureaktioita ja suurempi saanto.

 

Vakio-SPPS-menetelmä, mukaan lukien Boc (bentsyyli ) ja Fmoc (tBu ) -strategiat.

 

 

Boc (bentsyyli) strategia

Tässä synteesilähestymistavassa kiinteinä kantajina käytetään kloorimetyloituja, hydroksimetyloituja polystyreeni- ja p-metoksibentsyyli (PMA) hartseja. -aminoryhmä suojataan t-butoksikarbonyylillä (Boc), kun taas aminohappojen sivuketjuryhmät suojataan bentsyylijohdannaisilla. Boc-ryhmä poistetaan käyttämällä puhdasta TFA:ta tai TFA:ta CH2Cl2:ssa, ja synteesin lopussa sivuketjun suojaryhmät ja peptidi-hartsisidokset poistetaan vahvalla hapolla, kuten vedettömällä fluorivetyhapolla (HF) tai TFMSA:lla.

 

Fmoc (tBu ) -strategia

Tässä synteesilähestymistavassa kiinteinä kantajina käytetään Wang-hartsia, 2-klooritrityylikloridihartsia, Rink-amidi-AM-hartsia, Rink-amidi-MBHA-hartseja. -aminoryhmä on suojattu 9-fluorenyylimetoksikarbonyylillä (Fmoc). ), kun taas aminohappojen sivuketjuryhmät on suojattu happolabiileilla suojaryhmillä. Fmoc-ryhmä poistetaan käyttämällä 20 % piperidiiniä DMF:ssä, ja synteesin lopussa sivuketjun suojaryhmät ja peptidi-hartsisidokset poistetaan 1 % -95 % TFA:lla. Fmoc SPPS on tällä hetkellä edullinen menetelmä peptidisynteesiin.

 

Fmoc-kiinteän faasin peptidisynteesin perusperiaatteet

 

Valitse Hartsi

Fmoc SPPS:n yleisimmin käytetyt hartsit, mukaan lukien 4-alkoksibentsyylialkoholi (Wang) hartsi, 2-klooritrityylikloridihartsi, Rink Amide Resin, Rink Amide-MBHA -hartsit. Amidihartseja käytetään peptidien synteesiin, joissa on vaadittu C-terminaalinen amidointi. Wang-hartsia ja 2-Cl Trt -hartsia käytetään yleisesti synteesipeptideissä, joissa on vaadittu C-terminaalinen vapaa COOH. Mutta kun peptidin C-päässä on Pro ja Gly ensimmäisinä aminohappoina, Wang-hartsia ei tule käyttää DKP:n (diketopiperatsiini) muodostumisriskin vuoksi. 2-Klorotrityylikloridihartsia suositellaan käytettäväksi.

 

 

Suojattujen aminohappojen kiinnittäminen hartseihin

Ensimmäinen Fmoc-aminohappo kiinnittyy liukenemattomaan kantajahartsiin happolabiilin linkkerin kautta.

 

-aminosuojaryhmän suojauksen poisto

Väliaikainen Fmoc-suojaryhmä peptidyylihartsin N-päästä poistetaan käsittelemällä sitä liuoksella, jossa on 20 % piperidiiniä DMF:ssä. Tämä reaktio päättyy yleensä 10-20 minuutin kuluessa.

 

Pesuvaiheet

Jokaisen kemiallisen reaktion jälkeen suoritetaan pesuvaiheet ylimääräisten reagenssien, sivutuotteiden ja reagoimattomien molekyylien poistamiseksi hartsista. Tämä auttaa säilyttämään kasvavan peptidiketjun puhtauden.

 

Suojatun aminohapon aktivointi ja kytkentä

Hartsiin sitoutunut suojattu aminohappo aktivoituu sen reaktiivisuuden lisäämiseksi sekvenssin seuraavan aminohapon kanssa kytkeytymiselle. Yleisiä aktivointiaineita ovat HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU ja HATU. Kytkeminen sisältää peptidisidoksen muodostamisen aktivoidun aminohapon ja kasvavan peptidiketjun aminoryhmän välille. Kaiser-testiä käytetään tyypillisesti seuraamaan kytkentäreaktioiden täydellisyyttä.

 

Pesuvaiheet

Aiempien pesuvaiheiden tapaan tämä varmistaa ylimääräisten reagenssien ja sivutuotteiden poistamisen kytkentäreaktion jälkeen.

 

Katkaisu hartsista ja suojauksen poisto sivuketjua suojaavista ryhmistä

Kun haluttu peptidisekvenssi on syntetisoitu hartsille, se lohkaistaan ​​kiinteästä kantajasta käyttämällä katkaisusekoitusta, kuten trifluorietikkahappoa (TFA), joka sisältää sieppaajia, kuten tioanisolia ja vettä. Samanaikaisesti sivuketjua suojaavat ryhmät aminohappotähteistä poistetaan, mikä paljastaa täysin suojatun peptidin, joka on valmis puhdistukseen ja analyysiin.